分光光度分析-紫外及可见光分光光度法

（二）紫外光/可见光分光光度计
紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用高强度的钨灯作为光源，能够在可见光范围（400~700nm）调节。氘灯用于紫外分光光度测量（200~400nm）；使用氘灯时要用石英杯，因为紫外线不能透过玻璃。
分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束。实际上从这种单色一种产生的光不是某个波长的光，而是一段窄的带宽上的光，带宽是分光光度计的一个重要特性，这是由于它决定了吸收测量中所用的波长——普通分光光度计的带宽为5~10nm，用于研究的仪器的带宽小于1nm。
 因为光栅夹缝的宽度影响着带宽，带宽随光栅夹缝的宽度的减少而降低，要获得特定波长下的精确数据，尽可能使用最小的缝宽度。然而，减少了缝宽也会减少到达监测器的光度，降低了信/噪比。缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性于离散光的存在。
大多数UV/可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10nm。一次性塑料杯适合于对水和乙醇溶液在可见光范围内的测量。玻璃比色杯的生产要求更加严格的标准，因而在精确研究中要使用玻璃比色杯，尤其当溶液的吸收值很低时（<0.1），即使盛对照液与待测样品液的比色杯在光学性质上有稍许不同，也会导致结果偏差。玻璃和塑料会吸收UV光，因此在测波长小于300nm的吸收值时要使用石英杯。
进行测量之前，比色杯要保证干净，无划痕，外表面干燥，盛液到适当高度，并放在了比色槽中的正确位置。生物样品中蛋白质和核酸可能会在玻璃/石英杯的内表面沉积，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯内的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡过夜。腐蚀性及毒性溶液必须使用有盖子的比色杯，以防止溅出，破坏仪器。
基本分光光度计使用的光电管类似于比色计中所使用的光电管。许多情况下，当波长高于和低于550~600nm时必须使用不同的光电管，这是因为它们在可见光波长内的灵敏度不同，更精彩的仪器中所使用的是具有比光电管更高的灵敏度和稳定性的检测器。数字显示由于不易产生视觉错误和误读范围的错误，正逐渐代替指针读数。一些仪器可以直接给出所测定物质的浓度。
1．紫外光/可见光分光光度计的类型：
基本分光光度计只产生单束光。这种仪器首先用空白对照调到零吸收值，然后取出空白液，加入待测液，测定待测液的吸收值。也有一种双束分光光度计，有单色光源产生的光束被分为两束，一束穿过待测液，另一束穿过空白液。吸收值由一个电子线路通过对比透过待测液及空白液的出射光进行测定。双光束分光光度计减少了由于光源输出的不稳定或检测系统灵敏度的变化而导致的测量错误，这时由于待测液与对照液是同时进行测量的。记录式分光光度计是一种双束测定仪，用于记录已知波段下吸收值随时间的变化（如用于酶分析）。
2．分光光度计的定量分析：
假如已知一种物质在某一波长下的吸光率（通常是该物质的最大吸收值，这时灵敏度最高），这种物质纯溶液的浓度可用比尔－朗伯关系式算出。摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下，比色杯厚度为1cm时的吸收值。该值可以从光谱数据表中查到，也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线。这样，在所要求的浓度范围内，便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系，该直线的斜率即为摩尔吸光系数。
比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时，比色杯厚度为1cm时测定的吸光值。该值对于未知分子质量的物质如蛋白质核酸的测定很有用，这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示。使用公式Log10(Io/I)=εl[C]时，比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值。
这种简单的方法不能用于测定混合样品。在这种情况下，也许可以通过测量几个波长下的吸光度来估算每种成分的含量，如可用此方法在核酸存在下进行蛋白质含量的估算。
分光光度计的使用方法：
（1）接通电源；（2）使用前预热15min；（3）选择波长；（4）选择检测器；（5）如果可能的话，选择正确的缝宽；（6）插入适当的空白对照；（7）调解到0%的透过率；（8）将吸光值调到零；（9）分析样品；（10）每测量10个样品后，用空白对照校验零刻度；（11）检测仪器的可重复性。
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