[讨论]生物偏光显微镜在做免疫实验时的注意要点 [复制链接]

在进行免疫标记时，通常先将种属特异IgG分子生物索化，偏光显微镜并制备生物素或抗生物素蛋白与标记物的复合物，生物偏光显微镜利用生物素与抗生物素蛋白间的高亲和性反应识别抗原位置。偏光显微镜下面是标记物与抗生物素蛋白结合时免疫标记模式图。 5!~!j "q  
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此时，生物偏光显微镜二抗不是通过化学交连而是通过免疫学反应与标记物偶连。利用不标记抗体作为桥分子的主要优点是避免了化学交连对抗体活性可能产生的影响。PAP (Per-oxidase - A nt iperoxidase)法和铁蛋白一抗铁蛋白法均属此例。 T$u~E1  
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    偏光显微镜随着研究对象(组织、细胞、顺粒)，生物偏光显微镜抗原部位(细胞内，细胞表面，镶嵌于膜内)和观察方法(透射电镜、扫描电镜)的不同，偏光显微镜免疫标记的具体过程也各不相同。本节将介绍两种基本的免疫标记方法一包埋前法与包埋后法。 q&Q/?g>f  
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    偏光显微镜样品产生非特异结合的另一个来源是Fc受体。在巨噬细胞，B-淋巴细胞，嗜中性粒细胞和单核细胞表面均有Fc受体.研究这些细胞的表面抗原时最好使用Fab或F (ab'):代替完整抗体分子，偏光显微镜以避免F。生物偏光显微镜段与Fc受体的结合。 V7P6zAJy  
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    抗体不纯或效价太低都可能造成非特异结合。偏光显微镜免疫标记时应使用经过纯化的高效价抗体。生物偏光显微镜方法学不当是造成非特异结合的偏光显微镜最常见的原因.具体说来有下面几种可能: M2dm
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    (1)样品中的静电荷未封闭或封闭不全，由于静电相互作用抗体结合于样品。偏光显微镜在标记前，样品用1%BSA处理以及在一抗和二抗稀释液中加入1 %BSA都是为了封闭样品中的电荷。生物偏光显微镜如果效果不佳，偏光显微镜可试用0. 5 yo鸡蛋清蛋白或二抗种属的正常(偏光显微镜未经免疫的)血清(10%)或脱脂naifen((200"4%)代替BSA. P 4QkY#v  
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(2)经醛类固定后样品中游离醛基未封闭。生物偏光显微镜醛类固定后，样品经0.5mo1/L NH,CI处理是免疫电镜样品制备的必要步骤。偏光显微镜有时也可用0.05mol/L的赖氨酸或甘氨酸代替NH,C1。