光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是上世纪80年代开始投入实际应用的一种显微设备。与普通光学显微镜相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，并可以对观测样品进行分层扫描，实现样品的三维重建和测量分析; 与电子显微镜相比，LSCM可以在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值和膜电位等生理信号及活细胞形态的实时动态变化。因此，这项产品的面世是显微成像技术发展史中具有划时代意义的重大进展。LSCM在形态学、分子细胞生物学、神经学、药理学、遗传学等生物医学领域，以及材料学、地质学、水利学等工业工程领域有着广泛的应用。根据应用方向的不同，可分为生物用激光扫描共焦显微镜和工业用激光扫描共焦显微镜。 J](AJkGzK
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一.LSCM的基本原理及结构特点 \&"gCv#
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普通光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽，成像时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成像质量。而LSCM结构上采用精密共焦空间滤波，形成物象共轭的独特设计，激光经物镜焦平面上针孔形成点光源对样品扫描，于测量透镜焦平面的探测针孔处经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品不同焦平面发射来的干扰荧光。这是因为光学系统物象共轭，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图像，扫描后可得到信噪比极高的光学断层图像，分辨率比普通光学显微镜提高1.4倍。LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象地称为“显微CT”。 `cCsJm$ V"
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LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 ]w"r4HlCx
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二.LSCM的生物医学应用 KP%A0
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LSCM的高灵敏度、高分辨率、高放大倍数，提供了光学显微镜无法显示的结构，使细胞生物学研究上了一个台阶。目前我们可以在亚细胞水平进行动态实验，检测细胞生物质和离子通道的变化，观察细胞在生理、病理和药理情况下对外界因素作用所产生的快速反应，进行定性、定量、定时和定位的分析测量。最常用的功能是细胞三维重建、细胞荧光检测等。 ;3 O0O
1. 细胞的三维重建 A+_361KH
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 Ic P]EgB
2. 细胞定量荧光测定 1@egAo)
显微荧光光度计由于显微镜和激发光源的限制成像模糊，只能测定细胞内的荧光总量，有一定的误差。LSCM以激光为光源，对细胞分层扫描，单独测定，经积分后能得到细胞荧光的准确定量，重复性极佳。它适于活细胞的定量分析，可测定细胞内溶酶体、线粒体、DNA含量、RNA含量、酶和结构性蛋白质等物质含量和分布，常用于原位分子杂交、肿瘤细胞识别、单个活细胞水平的DNA损伤及修复的定量分析。它适于快速高灵敏度测量，减少光猝灭的影响，在定量免疫荧光测定方面应用广泛，如作各种肿瘤组织切片抗原表达的定量分析，监测肿瘤相关抗原表达的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用，监测自身免疫性疾病的多种抗原及药物对肌体免疫功能的作用，监测细胞结合和杀伤的形态特征并作定量分析等。细胞定量荧光测定可选用单荧光、双荧光方式，能自动测定细胞面积、平均荧光强度、积分荧光强度及形状因子等多种参数。 >2tYw,m
3. 细胞内钙离子pH值和其它离子的动态分析 3* 1c CM42
通过一些专用荧光探针，可对细胞内钙离子、钠离子及pH值等作荧光标记，并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。由于细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着重要作用，通过单标记或双标记对细胞内钙离子和其它离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达到毫秒级的快速变化。借助光学切片功能可以测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特性的变化。通过不同时间段的检测可测定细胞内离子的扩散速率，了解它对肿瘤启动因子、生长因子等刺激的反应。细胞内离子测量广泛用于肿瘤研究、组织胚胎学、细胞生物学和药理学等领域。 I ze+](
4. 细胞胞间通信和膜的流动性 &iORB
动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通信在细胞增殖和分化中起着重要作用。通过测量细胞缝隙连接分子的转移，可以研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通信的抑制作用及细胞内钙离子、pH值等对缝隙连接作用的影响，并监测环境毒素和药物在细胞增殖和分化中所起到的作用。选定经荧光染色后的细胞，借助于光漂白作用或光损伤作用使细胞部分或整体不发荧光，实时观察检测荧光的恢复过程，可直接反映细胞胞间通信结果。 +co VE^/w
细胞膜的流动性在进行膜的磷脂酸组成分析，药物作用点和药物作用效应，测定温度反应和物种比较方面有重要作用。细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，这种有序的运动自由度取决于荧光分子周围的膜流动性，所以极性测量能间接反映细胞膜的流动性。 **N{XxdN
综上所述，激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点，在细胞水平上可作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的一项重要研究手段。随着LSCM设备和应用技术的不断完善，它在生物医学和生命科学领域里将起到更重要的作用。
