1.1 人眼:人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下,在25cm的明视距离内,人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说,当两个物体相距不到0.1mm的时候,人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。
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人眼视锥细胞直径为4微米,对应的视角约为30秒,这个角度就是视角的极限。一般要能清晰的分辨两个点,视角须在1分以上。高1米的物体距眼睛3400米时,视角为1分。 edpW8eND
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1.2 放大镜:约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有3—5x
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1.3 显微镜: &u8z5pls8
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1590年,荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。生物论坛,生物秀论坛,中国生物科学论坛, r<yhI>>;<
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1673~1677年期间,列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 ?L|yaC~
19世纪70年代,德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 p538r[f<
1850年出现了偏光显微术; c`kQvXx
1893年出现了干涉显微术; 5H
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1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术, G[z
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荷兰眼镜制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜,尽管其放大倍数不超过10倍,但具有划时代的意义 m<@z}%v-
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1665 英国人Robert Hook用自己设计与制造的显微镜(放大倍数为40-140倍)观察了软木(栎树皮)的薄片,第一次描述了植物细胞的构造,并首次用拉丁文cella(小室)这个词来称呼他所看到的类似蜂巢的极小的封闭状小室(实际上只是观察到到纤维质的细胞壁)。 m5-9yQ=.
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列文虎克和他的显微镜(约1680 ) VKuAO$s$
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1680荷兰人A. van Leeuwenhoek成为皇家学会会员,一生中制作了200多台显微镜和500多个镜头。他是第一个看到活细胞的人,观察过原生动物、人类精子、鲑鱼的红细胞、牙垢中的细菌等等。 {fz$Z!8-
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2 显微镜的光学原理 YfDWM7x7,
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2.1折射和折射率.光线在均匀的各向同性介质中,两点之间以直线传播,当通过不同密度介质的透明物体时,则发生折射现象,这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。 Eipp~GD
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凸透镜的五种成象规律 ]U_ec*a
(1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时,则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象; y4jU{,
(2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时,则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象; .C!vr@@]
(3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象; id,NONb\
(4) 当物体位于透镜物方焦点上时,则象方不能成象; )K0i@hM(n
(5) 当物体位于透镜物方焦点以内时,则象方也无象的形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。 wCb(>pL0
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2.3显微镜的成像原理 GP,<`l&
显微镜和放大镜起着同样的作用,就是把近处的微小物体成一放大的像,以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方,离开物镜的距离大于物镜的焦距,但小于两倍物镜焦距。所以,它经物镜以后,必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。 A'B'靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身,而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 |>1hu1
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3 显微镜的几个基本概念 2<r\/-#pU
3.1 光源:能发射光波的物体。可见光频率范围:7.5×1014-3.9×1014 Hz。真空中对应的波长范围:390nm – 760nm相应光色:紫、蓝、青、绿、黄、橙、红 f8n
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3.2数值孔径 |b.z*G
⊙ 数值孔径简写NA,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数,是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低的重要标志。其数值的大小,分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 T>d.#
⊙ 数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角(u)半数的正弦之乘积。用公式表示如下:NA=nsinu/2 mP^SS
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⊙ 孔径角又称"镜口角",是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大,进入物镜的光通亮就越大,它与物镜的有效直径成正比,与焦点的距离成反比。 p3]Q^KFS
⊙ 显微镜观察时,若想增大NA值,孔径角是无法增大的,唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理,就产生了水浸物镜和油浸物镜,因介质的折射率n值大于1,NA值就能大于1。 sYn[uPefj
⊙ 数值孔径最大值为1.4,这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前,有用折射率高的溴萘作介质,溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。 pJ^NA2
⊙ 这里必须指出,为了充分发挥物镜数值孔径的作用,在观察时,聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。 xeA#u
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⊙ 数值孔径与其他技术参数有着密切的关系,它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比,与放大率成正比,与焦深成反比,NA值增大,视场宽度与工作距离都会相应地变小。 :tj-gDa\Y
3.3分辨率 SvuTc!$?
显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距,其计算公式是σ=λ/NA式中σ为最小分辨距离;λ为光线的波长;NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大,照明光线波长越短,则σ值越小,分辨率就越高。要提高分辨率,即减小σ值,可采取以下措施: &M[f&_"8Q
a. 降低波长λ值,使用短波长光源; T*>`,}J
b. 增大介质n值以提高NA值(NA=nsinu/2); wL{qD
c. 增大孔径角u值以提高NA值; Uems\I0
d. 增加明暗反差.