光学显微镜的分辨本领由于所用光波的波长而受到限制。小于光波波长的物体因衍射而不能成像。最高级的光学显微镜的分辨本领的限度约 200nm(2000)。为了突破这一限度，可采用电子射线来代替光波。电子微粒以高速运动时，其行为类似光波的传播过程。运动电子的波长随其速度而定， 在增压达50万伏时，其波长为0.001nm(0.01),即电子射线的波长约为可见光的十万分之一,其分辨本领的极限约为4，其放大倍数比最高级的光学 显微镜要高很多级。以电子射线为电子光源的显微镜称为电子显微镜。现代医学和生物学使用的电镜分辨率为5～10,即放大率为10～20万倍。 C8)s6
由于标本厚薄不同，超薄切片机切出的很薄的标本，可用透射式电子显微镜观察。不能切得很薄的标本可用扫描式电镜进行观察。 +<V $G/ "
透 射式电子显微镜(TEM) 是最常用的电子显微镜，由电子枪、电磁透镜系统、荧光屏（或照相机）、镜筒、镜座、变压器、稳压装置、高压电缆、真空泵系统、操纵台等部分组成电子枪相当 于光学显微镜中的光源,供应和加速从阴极热钨丝发射出来的电子束。电镜所用的电压一般在20～30万伏特，才足以使电子枪里的电子以高速飞出。电子通过聚 光透镜，达到标本上，因为标本很薄，高速电子可以透过，并且由于标本各部分的厚度或密度不同，通过的电子就有疏密之分。电压需要严格稳定才能使成像稳定， 很小的电压改变就会引起严重干扰。像的亮度可以通过电子枪来控制。 =JP Y{'V O
电磁透镜组相当于光镜中的聚光器、物镜及目镜系统。电子束通过各个电磁透镜 的圆形磁场的中心时可被会聚而产生像。电镜的透镜系统由4组电磁透镜组成,包括聚光透镜、物镜、中间透镜和投射透镜(目镜)。可改变聚光透镜的电流使电子 束对标本聚焦并提供“照明”。物镜靠近标本的焦点上。通过物镜、中间镜和投射镜的三级放大，能在一定的距离处得到高倍的放大像，最终形成的像投射到荧光屏 上。在荧光屏部位可换用黑白胶片以制取相片底板。改变电磁线圈中的电流量从而使电磁透镜调焦，并产生不同的放大率 5
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为了尽量减少电镜中电子与空气分子相碰撞而产生散射的机会，镜筒中的真空度要求很高，因此密封的镜筒与真空泵相连。由于标本需置于真空的镜筒内，因此不能检查活材料。 7
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光 镜主要利用可见光波作为光源，样品染色后改变了光的波长(颜色)和振幅（亮度），影响了反差从而得到图像。电镜使用电子射线。电子束的穿透力不强，所以供 电镜检查的标本必须切到薄至50～ 100nm厚度的切片。电镜切片的制作步骤与光镜切片类似，也是由固定、脱水、包埋、切片和染色等程序组成：首先从欲观察的标本上取材,体积约1。通过戊 二醛和四氧化锇双固定后，逐级酒精（或丙酮）脱水,环氧树脂包埋,超薄切片机切片。在电镜中像的形成是组织片各个部分对电子束的电子产生不同散射的结果， 标本中致密的地方(细节)散射强。可使用各种重金属盐染色以增加反差，常用的是醋酸铀和枸橼酸铅复染。由于电子束穿不透玻璃，染好的薄膜切片放在小铜网格 上作电镜观察。 Zn Rj}y
冷冻蚀刻技术是50年代发明、后来经过改进的一种新的电镜标本加工技术。其主要原理是把液氮内快速超低温(-200℃)冷冻的 生物标本放在真空冷冻装置里断裂，从而将不同部位的细胞器内部结构暴露出来，表现出高低不等的三维结构。在新形成的折断面上喷镀一层铂金碳膜（复型）。将 已镀膜标本在强酸或强碱性腐蚀溶液里消化，复型膜即漂浮、经打捞、清洗，放在小铜网上进行电镜观察和照相。冷冻蚀刻技术在细胞生物膜结构（如细胞膜、线粒 体、内质网等）的研究上发挥了重大作用。 > ){}nlQf
扫描式电子显微镜(SEM) 标本较厚的表面要产生一个电子光学图像就要采用电子扫描法（图9 [扫描电子显微镜结构示意图]）。扫描电镜的电子枪和电磁透镜的结构原理类似透射电镜。电子枪产生的大量电子通过三组电磁透镜的连续会聚形成一条很细的电 子射线（电子探针）。这条电子射线在电镜筒内两对偏转线圈的作用下，顺序在标本表面扫描。由于来自锯齿波发生器的电流同时供应电镜镜筒内的和显示管的两组 偏转线圈，使得显示器的电子射线在荧光屏上产生同步扫描。从标本上射出的电子经探测器收集，被视频放大器放大并控制显示管亮度。因此在荧光屏上扫描的亮度 被标本表面相应点所产生的电子数量所控制，因而在荧光屏上显示出标本的高倍放大像。通过控制两套偏转线圈的电流便可控制放大率的倍数。另外安装有一个同样 的照相用同步扫描显示管。 )S`Yl;o L
扫描电镜标本制作中，既要脱水又要基本保持其自然状态，因此使用标本的临界冷冻干燥技术：将组织表面清洗干净，经戊 二醛和四氧化锇双重固定，逐级丙酮脱水。由于乙酸戊酯与液化Co置换十分容易,因此首先用梯度乙酸戊酯置换丙酮。然后将标本放入密闭耐压室内，导入液态 Co，使之浸没标本。很快Co将标本内乙酸戊酯完全置换出来，将后者排出耐压室。同时耐压室内的液态Co与迅速蒸发的气态Co分子之间的互变达到动态平 衡。使温度逐渐上升,液态Co蒸发加快而密度相应降低。达到Co的临界温度31.1℃时,气、液二相密度相同，二相的差异完全消失，即达到相的平衡，此时 表面张力为零。使温度继续保持在稍高于临界温度的条件下，缓慢排出Co气体,当Co排尽时,标本即已干燥。取出干燥好的标本，经真空喷镀一层碳合金，或放 入离子镀膜机内镀铂和金，以增加标本的导电能力，加强反差和增强标本的稳定性。然后即可进行扫描电镜观察。 Ik A~+6UY
扫描电镜具有分辨率高、景深长、视野广、显示三维立体结构、便于观察和标本制备简单等许多优点，在生物学及医学上应用愈来愈多，用以观察和研究生物标本的表现形态和内部立体结构。扫描电镜的分辨本领已达到70的水平，已可以直接观察脱氧核糖核酸(DNA)的分子结构。 k!$$ *a*
