今天和大家谈谈显微镜当中最重要的部件：
物镜。为什么是最重要且没有之一呢？因为科研工作者们关心的解析度、信噪比等与
成像质量息息相关的
参数都是由物镜决定的。当然，显微镜的其他部分也一样不可或缺，但是篇幅有限，即便是物镜，我们也只能浅尝辄止的谈一谈。
=>-:o:Cu{ PaP47>( 在生命科学研究领域，
光学显微镜的使用率绝对位列仪器的前三甲，如果有人不相信，那请看看周围吧，不管是在实验室，还是在医院，我们都随处可见显微镜们靓丽的身影。
9n]z h- 而随着科学技术的不断进步，在光学显微镜的基础上，衍生出许多其他复杂的成像
系统。例如全内反射荧光显微镜、
激光共聚焦扫描显微镜、多
光子激光扫描显微镜等等。绝大多数的科研工作者们，都需要或多或少的和显微镜大家族中的成员们打交道。这个时候，对这些复杂系统的了解就有一些迫切了。
'*MNRduE6 那么作为物镜当中，最不可不谈的东西就是物镜的最重要的参数：数值孔径。
k { _X%H/ |Kky+* /Z';# G,z 数值孔径即Numerical Aperture 所以在中国我们通常称之为NA值，NA值的大小直接标注在物镜上，大家平时切换物镜的时候，有观察过吗？通常来说NA值越大，物镜的成像质量越好。为什么会这么说呢？我们先来看看数值孔径的计算公式：
+e);lS"+/ NA = n (sin μ)
N &K :Jp 其中n是物镜与样本之间介质的折射系数，μ是物镜孔径角的一半。
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@ 作为生命科学领域的研究者，我们不必去深究为什么NA的公式是如上所示，但是，我们需要了解的是为什么NA值是物镜最重要的参数，所以趁热打铁，我们再看看下面两个公式：
a)^f`s^aa R= 1.22λ / [NAObj + NACon]
DlC`GZEtqh R = 1.22 • λ/(2 • NA)
t%Vc1H2} 上面两个公式的左边R，决定了物镜的分辨率，即物镜可以区分两点间的最短距离。接着我们再看看公式的右边，λ是入射光的
波长，实验条件恒定的情况下，跟数值一样都是定制，而我们看到NA都是处在分母的位置上，即NA值越大，R的数值就越小，分辨率就越高，所以我们观察样本的解析度就越高，通俗点来说，就是可放大的倍率越大。那么为什么会两个公式呢？因为第一个是透射光的计算公式，另一个是反射光的。顺带一提的是，通常来说NACon即聚光镜的数值孔径要小于高倍物镜的数值孔径，所以荧光成像的分辨率要高于明场成像。
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8#f& 谈到反射光，作为现如今最重要的成像手段，荧光成像在显微成像领域毋庸置疑的处在垄断地位，这里笔者不得不多谈一下她，因此为大家介绍如下公式：
f;!1=/5u- Intensity ∝ (NAobj)4/Mag2
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S 在这个公式中Intensity的大小指的是荧光的强度值，而NA值这一次出现在了分子的位置，所以NA值越大，荧光强度越大，所以得到的荧光图像信噪比越高，图片质量越好。如果是进行时间序列成像，高NA值的物镜，还能大大减少曝光时间，提高成像速度，从而更好的捕捉快速移动的荧光标记物。
T~J6(," 综上所述，虽然较为粗略和浅显，但是我们依然可以大致了解NA值的重要性，同时也对物镜也有了初步的了解，那么随之而来的问题就出现了：
r0379 _ NA既然如此重要，为什么物镜种类却如此千差万别 ？
}OZ%U2P U 既然NA值如此重要，显微镜厂商们都只生产高数值孔径的物镜不就好了？为什么还要生产那么多种类繁多的物镜呢？我们再回过来看看NA的计算公式：
Ac 0C,*|^ NA = n (sin μ)
1q0DOf]!T NA的大小跟介质的折射率有着直接的关系，如果各位生命科学研究者高中数学还没有忘干净的话，应该知道sin最大值只有1，所以介质折射率越大，物镜的NA值越大，这也是为什么我们高倍显微镜是油镜的原因。
A6v02WG_1T 答案也就随之而来，很显然，如果样本不能接触，或是加入其他介质，我们就只能选择空气作为介质，从而限制里物镜的NA值大小。那么如果可接触的话，是不是所有的样本都用高折射率的介质呢？下面我们再来看看下面要说的概念。
}]$%aMxy T 深层成像：球差的困扰！
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yqOhb4 上面这组实验中，我们对折射率为1.38的样本进行了200um的成像，分别用了三种不同的介质，分别是：水折射率为1.33；硅油折射率为1.40；油折射率为1.51。在样本表面成像时，油介质无愧其高NA值的强大特性，成像亮度是三种物镜之中最高的，但是当观察深度至200um的时候，油介质的物镜基本无法观察到荧光型号，而在深层观察时，成像质量最好的是折射率为1.4的硅油物镜。Why？细心的同学们应该会发现，我们所用的样本介质为1.38，而硅油的折射率是最接近样本的，所以在深层成像的时候，介质差所造成的球差就会被减到最小。这种光学现象对于学生物的同学来说可能较难理解，但是我们从左边的示意图可以看出来，当介质相近的时候，光路的焦点汇聚更加容易而不会产生在深层观察时候
光线分散的情况，从而能获得较好的深层次的荧光信号。
\`}Rdr!p% 由上面这组实验，我们可以得到很多有用的信息，好学的同学就会去查询自己常用的样本的折射率了吧？通常来说细胞样本的折射率在1.33~1.35，活体或者厚组织的折射率在1.36~1.38，因此，当我们的实验需要进行深层成像的时候，对于细胞样本我们需要尽量选用水介质的物镜，而当进行厚组织样本或者果蝇斑马鱼这样的活体深层成像时，使用硅油介质的物镜得到的图像质量会更加出色。当然，如果只是样本表面成像，油镜的成像质量绝对是最好的。
7tP?([o%F 伴随着深层成像的迫切需求，空间的共定位分析，也被各位研究者们广泛使用，传统的2D共定位分析得到的结果往往是错误的不真实的。但是对于空间共定位来说，我们不可避免的就又要考虑另一个重要的物镜参数色差矫正。
zPEx;lO$ 空间共定位分析：不可不谈的色差
xQ\/6| 色差是什么？色差又是如何产生的？上面的图例中展示的就是色差的概念。通俗点来说就是由于不同颜色的光波长不一样，所以当她们通过光学部件的速度也不一样，因此产生了一个光斑在成像的时候颜色分散开的情况产生，这就是色差。
mRZC98$ @r -lV]( (I& 对于显微镜厂商的高端物镜系列，对于绿色红色的矫正都相当的出色，但是，绝大多数厂家对于近紫外的矫正都不尽如人意。这一点瑕疵在进行空间核定位的时候，就会出现很严重的问题，在获得成像结果之后，我们很难确定我们的荧光标记物与核的关系是真实的，还是由于色差造成的。
>&6pBtC_ 对此，各家厂商都有相对应的手段，但是只有OLYMPUS显微镜在物镜上下了功夫，推出了一款号称SC（超级色差矫正）的60倍物镜，恰巧笔者手上真好有这枚物镜，便做了如下测试。
K:gxGRE 上组实验图片用自发荧光小球作为样本，用不同激发光成像，之后做了3D重构。从图片中我们可以看出，即便是OLYMPUS的高端物镜近紫外的色差依然有0.5um左右的偏差，而SC物镜的两种颜色基本切合，误差要小于0.1um，基本上在核定位上就可以得到比较真实的实验结果了。
_tTtq/ z< DygMavA. 说了这么多概念性的东西，其实仅仅只是管中窥豹，显微镜系统要更加复杂的多，在最后的篇幅中，笔者也紧跟时代潮流，谈谈现在打得火热的双光子显微镜的物镜。
qqA(Swe)T qL.1N~$2 双光子的成像原理使用过双光子的同学们应该都很清楚，不同于普通的光学显微镜和共聚焦系统所采用的线性光学，双光子成像原理采用的是非线性光学，同时
光源也不再是传统的可见光，在物镜的设计上不再是传统那种“真实还原样本”这样的理念了。针对双光子成像OLYMPUS最早推出了双光子成像的专用物镜，在之后Nikon也紧跟步伐推出了相应的产品。
)XV|D \W=~@k 双光子物镜首先最重要的是NA值尽量的大，这样可以有效的提高激发效率。同时，由于使用近红外成像，物镜的色差矫正也不再针对可见光而是专门对于近红外光进行矫正。在保证高NA的同时，双光子物镜的放大倍率会较小，这样可以有效的提高收集视场，增加我们收集散射荧光信号的能力，从而提高成像质量。当然，这种双光子专用物镜只能使用在双子系统上，若是在共聚焦系统中使用，效果是要大打折扣的。
