用于精确生物成像的新型高速双光子显微镜

双光子显微镜（TPM）使研究人员能够以高分辨率观察活组织中复杂的生物过程，从而彻底改变了生物学领域。与传统的荧光显微镜技术相比，TPM利用低能光子激发荧光分子进行观察。反过来，这使得可以更深入地穿透组织，并确保荧光分子或荧光团不会被激发激光永久损坏。

然而，一些生物过程太快而无法记录，即使使用最先进的TPM。限制 TPM 性能的设计参数之一是线路扫描频率，以每秒帧数 （FPS） 为单位。这是指激发激光沿一个方向（例如，在水平扫描中）扫描目标样品的速率。缓慢的扫描频率也会影响系统的整体FPS，因为它决定了激光扫过另一个方向的速度，即垂直扫描。总之，这些在显微镜的时间分辨率和观察框的尺寸之间产生了权衡。

通过结合两种激光扫描模式，研究人员开发了一种多功能的双光子显微镜系统，可用于以高帧速率和空间分辨率观察极快的生物过程。

为了解决这个问题，来自中国和德国的一个国际研究小组最近开发了一种功能强大的TPM设置，具有前所未有的高线扫描频率。根据他们发表在《神经光子学》上的报告，这种显微镜系统设计用于以高时间和空间分辨率对快速生物过程进行成像。

将所提出的TPM与传统TPM区分开来的关键因素之一是使用声光偏转器（AOD）来控制激发激光器的扫描。AOD是一种特殊类型的晶体，其折射率可以通过声波精确控制。反过来，这使我们能够根据需要重定向激光束通过它。更重要的是，与传统TPM中使用的振镜相比，AOD可实现更快的激光转向。

因此，该团队使用二氧化碲（TeO）设计了一种具有极高声速的定制AOD晶体，实现高线扫描频率。使用此AOD，激光器可以在短短2.5微秒内扫描帧中的一条线，对应于400 kHz的最大线扫描频率。同样，该团队使用AOD在另一个方向上实现了合理的慢扫描频率。

为了进一步提高显微镜的适应性，该团队增加了在必要时切换到基于振镜的激光扫描机制的选项。这允许以可接受的分辨率和速度扫描样品的大区域，从而在切换到AOD扫描之前更容易找到感兴趣的小区域。

该团队对新设计的TPM进行了几次概念验证实验。他们在基因工程小鼠上安装了颅窗，并用它们来观察神经元的形态和活动以及单个红细胞（RBC）的运动。该系统使用适当的 AOD 配置和帧大小实现了高达10,000 FPS 的帧速率。这足以精确测量钙在神经元树突中传播的速度，以及可视化血管内单个红细胞的轨迹。

加州大学伯克利分校神经光子学副主编兼Luis Alvarez实验物理学纪念主席Na Ji博士对这些结果印象深刻，他说：“基于AOD的扫描显微镜的新系统代表了成像速度和性能的显着提高，正如其在体内钙信号传播和血流测量中的应用所证明的那样。

展望未来，新的概念验证TPM设计将使捕获快速生物过程成为可能，并可以显着提高我们对它们的理解。

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