超分辨显微：突破衍射极限，向纳米分辨进军！

衍射极限

我们能看到什么？看到多小的范围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。

人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。

此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”———衍射极限。

1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。

阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限。

这就是为什么后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，人们借助它们可以看得更“细”。那么，这些设备有没有突破衍射极限呢？他们依然遵循着阿贝衍射极限。这些设备的使用的是电子束等波长非常短的入射光，自然，它们的分辨率就高。比如电子显微镜，分辨率可以达到0.5埃（一埃等于十分之一纳米），这样就可以看到一粒一粒的原子。

突破衍射极限

那么，光学显微镜是否已经完成它的使命，可以退出历史舞台了呢？目前，光学显微镜的研发还是世界科学家的研究热点。生物学、医学方面的研究，更希望在生命体存活的自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟的优势。突破性的进展发生在本世纪初，一个是德国哥根廷大学的StefanHell教授提出的STED方法，一个是哈佛大学的庄小威提出的STORM方法。

STED的方法可以理解为“以光制光”。用另外一束环状的光“叠加包围”原有的光斑，这样，原有的光斑的外围部分会得到削弱，我们看到的就是更小的聚焦的点，这样就会提高分辨率。采用这种方法的光学显微镜，分辨率可以达到30~50纳米，可以清晰地看到细胞内部的微管。

2006年，哈佛大学庄小威从化学生物学角度提出了她的新方法，利用荧光探针家族，实现了多色随机光学重建显微法（multicolorstochasticopticalreconstructionmicroscopy）。她的核心原理是利用光线“开关”，“随机”地让被观测物体上的点发光或熄灭，这样就拉远了两个发光点之间的距离，相机不断动态捕捉这样的成像，再经过计算机分析，就会形成被观测物体整体的图像。这种方法，把光学显微镜的成像推进到20-30纳米级别的分辨率，在《Science》杂志上，课题组演示了DNA模式样品和哺乳动物细胞的多色成像。

以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。美国光学学会把它列为21世纪光学五大研究计划之首。