[原创]流式细胞仪(思路较完整版) [复制链接]

工作太忙,不知道更得了更不了了.... }I6vqG  
上面的所有东西形成三个可能性约束: H1(Uw:V8  
1.光谱测试分辨率不需要很高,而是需要准确地判定染料的非窄带光谱及其强度... _OC<[A  
2.全测试区域确实为200X200UM,可重点测试区域是200X100或200X150UM. 9lDhIqx0~  
3.测量灵敏度要高,但高到什么程度是未知的,需要实验测试... !o[7wKrXb  

图片:未命名A.JPG

Oh\<VvZuN  
这些都是图片里提到的,而且按照图片的推理,貌似一切都是可以成功的....但这个只是为了一个题目而已,实际这个项目按这么做早就挂了...

由上面的3个条件之前的因素不只这里提到的这些 #@~+HC=  
需要追加: _ T):G6C8  
7.Z轴位置不只不固定,被采集过程还有可能是一半在区域内一半在区域外的 <r`2)[7N  
8.被照明目标存在侧向散射,而其侧向散射是可能影响相临细胞的 
K_ ~"}  
9.其实细胞的发光不是4PI空间的均匀分布. `o8/(`a  
KOuCHqCfq  
他们确实会得到原来的3个技术要点但却有所不同 xJ)n4)  
1.分辨率一致; hL;(C)(  
2.区域是否200UM,首先要根据荧光显微镜观察:  A运动细胞统计间距,B运行速度,C排列方向(重点是同细胞每次开启关闭流动之后排列方式变化) b4ONh%  
    区域内无差别采集一致 ,1CIBFY  
3.效率及灵敏度不是可用,是必须可用灵敏度的至少2倍以上(前提是假设细胞统计最小中心距>2倍细胞大小,如果2的显微镜观测并非如此,灵敏倍率还要变化)..(原因是为了采集到准确数据,每个细胞等效时间需要拍照2次,从而去除非全细胞的失误数据) 6U,O*WJ%e  
而3的方式不是绝对的,还有一种采集方式是累积暴光最后分析,这种需要的灵敏度偏低,可以多次叠加暴光收集统计数据... YCM]VDx4u1  
当然无论采用哪种,样品阶段都要以兼容为目的,连拍单细胞采集和累积暴光都可以做测试才行(已有机器抄袭例外,这里只讨论没有人做过此产品的情况下该如何进行) :GP]P^M;G@  
Uu(SR/R}  
$,}E   

这些要点得到的和PPT实际也不同: <_tT<5'[$u  
要点共同用得到的是: YSh+pr  
au=o6WRa  
1.可采用狭缝光谱仪及非运动细胞配合测试灵敏度,如果暴光速度很快,样品可以使用现有光谱仪 >eB\(EP  
   如果暴光速度过慢,要依据此次暴光得到的数据重新设计光谱仪 G) 7;;  
()+<)hg}2  
2.激发光要非常均匀,可以高频地开关,照明区域受限在采集区域内不止要集中大部分能量,而且边界要尽力截止防止区域外细胞被激发的影响(虽然荧光不会立刻消失,起码要防止来方向细胞的因素,因为这个有不确定性,去方向细胞的荧光干扰可以记录软件大概率排除) vUU9$x  
O_DtvjI'  
3.激发光区域和采集区域的原则是,1/2细胞统计间距平均值或均方根的整数倍,根据灵敏度测试及使用要求确定整数的上下限. x+x40!+\  
0#&5.Gr)  
4.区域内任何空间点的激发采集都要是一致的,或根据要求差异不大于?%\ fb8g7H|  
RyK\uv  
5.目标采集角度根据两个条件确定,A是灵敏度,B是观测细胞方向,这个比较复杂如果观测多细胞方向全部随机那么B忽略, 如果观测多细胞方向全部相似B忽略, 如果观测多细胞方向较为一致但每次关闭开启后由于聚焦条件变化多次开关整体不同就要测试荧光发光角度(接下来的讨论假设这种低概率情况不存在,假设显微镜观察到的所有细胞都是随即方向的) (>GK\=:<  
    这条按照细胞方向随机以灵敏度判定采集角度,   并假设已采购光谱仪测试灵敏度完成得到结论全30度水中张角的采集加上重新设计的光谱仪能达到之上2倍可用灵敏度. I@%t.%O Jp  
L>%o[tS  

继续干活,过段时间再更吧..............

感觉用荧光显微镜来测难度有点欠准确，遇到的干扰光会较多。流式细胞仪，光学是核心检测子系统，但与你配合的液路和硬件同样非常关键。光学系统做的再好，如果相关子系统扯后腿，最后的效果会比你预想的差得多。

measure123:感觉用荧光显微镜来测难度有点欠准确，遇到的干扰光会较多。流式细胞仪，光学是核心检测子系统，但与你配合的液路和硬件同样非常关键。光学系统做的再好，如果相关子系统扯后腿，最后的效果会比你预想的差得多。 (2016-11-30 16:57) %T9 sz4V  

V-r3-b  
没错，这应该只是一种概率统计后的半定量方法，不是完美方法。看将来进步会不会有更优方法了。 $aPfGZ<i  

谢谢楼主！不知道，您对于前向散射角，有没有研究！

散射通道和荧光通道收集信号的透镜，与石英池之后的透镜，放大倍数多少会比较适合了？还是说只要在检测器光敏区范围内均可？

感谢分享