显微摄影是一项重要的显微技术,同再现显微镜中物体影象的各种方法比较,显微摄影是最好的方法。它对以显微镜作为研究工具的研究人员是必备的手段,尤其在研究染色体及其分子特征时,就更加显得必要了。现在数码相机的问世,又使显微摄影变得更为简便,且效果好。在有关学术研究和理论探讨时,一帧好的显微照片,可以省去许多的文字描述,并且使人心悦诚服。何况在生物学领域中,确有不少问题的研究,必须借助显微摄影。 :b,^J&~/)1
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下面,仅以植物染色体作为拍摄材料,概述显微摄影的基本方法,数码显微摄影的操作流程和传统的显微摄影基本一样,只是省去了底片和暗房技术,由计算机完成。 j,2l8?
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一、显微摄影对制片标本的要求 swc@34ei\
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染色体只见于有丝分裂和减数分裂的细胞核中,根尖、茎端、幼嫩花药和胚珠是镜检染色体的材料,尤以根尖和花药更为常用。观察染色体的形态、结构和数量,常用酶解或压片法制片。此法能保持染色体的完整,并能接近于活体状态。一张好的显微照片,来源于完好的染色体制片标本。适于拍照的制片标本,应具下列条件: 41 vL"P
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1、选用标准的载玻片和盖玻片 光源入射光束,经载玻片透射标本,再经盖玻片进入物镜,处于光路之中的玻璃,应是表面无伤,内无气泡;外无霉斑。这样可以杜绝光线乱反射,防止阻光、降低亮度以及有损清晰度。载玻片厚度不宜超出聚光镜的焦距,一般在2毫米以内,可将光源的光束集中于载玻片的标本上。盖玻片的标准厚度为0.17毫米,若使用厚度大于工作距离的盖玻片,物镜前透镜会触及盖玻片,同时不能准焦;盖片厚,球差就大,会降低影象质量。有效盖片厚度,包括封固剂的厚度,即树胶或尤派胶用量,因此,封固剂要调稀,少许滴加一薄层。 VZIR4J[\.
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2、染色体处于相宜的时期,平展逸散,完整无损 染色体的计数和组型分析,以有丝分裂的中期(或晚前期),减数分裂的终变期和粗线期为宜。这时染色体收缩变短,呈典型状态,易识别。通过前处理的精细加工,染色体相互逸散,互不接触,并尽可能使之平展于同一水平面上,又不失细胞的完整轮廊(图3-1)。 lKEa)KF[
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3、染色鲜明适度 染色体过染,染料堆积,使染色体模糊成一块,难以辨别细节,缺乏质感;染色体着色过浅,使影象不鲜明,辨认不清,反差不大。染色体染色以蓝紫为佳,色彩鲜明,胶片易感受,拍摄效果好。一般多用铁矾苏木精染色制片。当然,醋酸洋红和孚尔根反应也可以。细胞质染色应浅淡,以辨清细胞质的完整轮廓为准。常用铁矾苏木精过染,再用45%醋酸软化和分色,结果染色体着色蓝黑而鲜明,细胞质浅淡而不明显,增大了色彩的对比,扩大了影象的明暗反差。 ,`8Y8
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4、清洁无尘,消除气泡 制片中的灰尘异物和气泡,有损影象的质量,防碍观察。气泡为临时制片的常见弊病,小的气泡有碍观瞻;大的气泡连片,推挤染色体,堆积集中,损坏了好的影象。要随时滴加所用的临时封固液,消除气泡。 I}Xg&-L
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二、选用优质物镜和接目镜 (a6?s{(
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显微摄影是以接物镜和接目镜作为摄影镜头,其中接物镜尤为重要,物镜的分辨率就是显微镜的分辨率。目镜与显微镜的分辨率无关,它只有把物镜已放大的影象进一步放大,既使是最好的目镜,也无法观察到未被物镜分辨的细节。所以摄影时,物镜要严格选择,不可任意滥用。 NgB 7?]vu
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1、物镜 接物镜种类繁多,光学性能相差悬殊。摄影时必须选用得当,绝非任一物镜皆可产生最佳影象。 `$z)$VuP
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物镜由透镜组成。单片透镜具有多种象差,一个完善的物镜,是由一组复杂的透镜组成。按象差矫正程度,物镜可分消色差物镜,复消色差物镜,萤石物镜和平象物镜等类别。 rFL$QC2
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消色差物镜,因制造容易,是最常见的物镜。金属外壳上不刻代表(图3-4左)。该物镜将光谱中红光和蓝光聚焦于一点,黄绿光则聚焦于另一点。其最佳清晰范围是在510μm(毫微米)绿光区至630μm橙光区间(图3-2Ach红)。消色差物镜性能较差,不适于显微摄影。因未经矫正的蓝光对感光胶片的乳剂膜非常敏感,全色胶片对未经矫正的红光也能感应。如果必须使用时,加用黄绿色滤色片,也可获得清晰的影象。 }+Vv0jX|V
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复消色差物镜的性能很高,能将可见光谱中的红、蓝和黄光聚焦于一点,改正了红、蓝色光的球差和其他象差。最佳清晰范围从波长400nm至720nm(图3-2Apo线),容纳了全部可见光谱。适于任何色光下或加用各色滤色镜摄影,更适于彩色摄影。但是,复消色差物镜残留有象场弯曲,使平面物体形成类似球形弯曲的影象。结果使视野中心和边缘的影象不能同时准焦,给摄影带来不便。拍出的底片中心清晰边缘模糊或相反。象场弯曲可以通过选用特殊的目镜加以克服矫正。复消色差物镜的金属外壳,刻有“Apo”字样,供作识别(图3-3)。 5`E))?*"Pe
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萤石物镜,色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间,故又可称半复消色差物镜。最佳清晰范围在波长430nm至680nm(图3-2 l线),包括了绝大部分可见光谱。适于黑白和彩色摄影,可加用各色滤色镜,物镜外壳刻有“F1”字样(图3-4右)。 Vul+]h[!h
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鉴于倍数愈高物镜的象场弯曲愈显著,歪曲影象,降低摄影质量,难以获得完美的底片。现今,已研制出清除象场弯曲的一系列平象物镜。平象物镜,校正了象正场弯曲,不存在视野中心与边缘不同时准焦的现象。由于将影象展平,在同样倍数下,有效影象要比一般物镜的影象稍大。为当今理想的摄影物镜,应积极选用。平象物镜有多种类别,外壳上刻有不同的字样,以资识别。如“Plan”(平象),“Pl”(广视野平象)、“NPl”(正常视野平象),“Planachromate”(平象消色差)、“Pl Apo”(平象昨消色差)等(图3-5)。 [B?z1z8l
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物镜在使用时,按其前透镜与标本间介质的不同,分为干燥系和浸没系物镜。浸没系物镜外壳前端,常刻一黑环,以便识别。油浸物镜外壳刻有“Oel”、“Oil”、“Hl”字样;水浸系物镜刻有“W”、“Water”;甘油浸没系物镜刻有“Glyc”、“Glyz”,通常油浸物镜只有90×和100×(图3-6)高倍物镜。个别显微镜配有63×或40×的中倍油浸物镜,其中尤以63×的油浸物镜,质量最佳,非常适于显微摄影。在焦距和数值孔径相同时,浸没物镜的象差校正比干燥物镜完善,成象质量好。由于浸没液折射率大于空气的折射率,从而提高了物镜的分辨率。同时,这层介质可使入射物镜的光线提高,提高视野亮度。采用浸没物镜,可消除物镜前端透镜表面的杂乱反射光,减少有害的反射光量,使物体影象反差增加。 P?3{z="LzJ
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2、目镜 目镜亦参与造象,把物镜映来的影象进一步扩大,并校正物镜余下的象差和色差。目镜作为投影器,把放大的影象投射在暗箱的焦平面上。目镜种类多,光学性能差异较大,一定类型的物镜必须选用一定类型的目镜相互组合。绝非只要有好的物镜,随便一种目镜都可用来摄影。 y>(rZ^y&
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附有摄影装置的显微镜,备有摄影目镜,专用摄影,不宜作为观察用。这种目镜能较好的校正象场弯曲,提高成象质量。摄影目镜上刻有“Photo”、“FK”等字样。 =V^@%YIn
平象目镜也是一种适于摄影的目镜。有专用摄影目镜,选用平象目镜配合平象物镜一起使用,可以获得很好的摄影效果。目镜刻有“Plan”、“Periplan”、“GF”、“GW”和“Kpl”等字样。 zb2K;%Qs+f
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3、物镜与目镜组合 为提高影象质量,消除象差和色差,在选配物镜和目镜组合时,从类别上进行选择,如用平象复消色差物镜和摄影目镜或平象目镜组合使用。此外,物镜的数值孔径和放大倍数,以及目镜的放大倍数,更要考虑这涉及有效放大率、分辨率、焦点深度和视野宽度等几个与摄影质量相关的问题。所以,选用物镜和目镜时,要考虑下述几个问题: En9R>A;`
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(1)有效放大率:显微镜辨别微小物体和细节的能力,取决于分辨率,不在于放大倍数。分辨率决定于物镜,而与目镜无关。显微镜的有效放大率,为所用物镜数值孔径的500-1,000倍。数值孔径常简写为N.A.,其数值刻在物镜上。例如,使用数值孔径为0.65的40×物镜,其有效的放大倍数为325-650倍。为达此倍数,要选用8-16倍的目镜。高于16×目镜所得放大倍数叫做“空的放大”,对影象细节的分辨,没有丝毫提高。目镜倍数太低,总放大倍数太小,物镜分辨率不能充分发挥,本来可以辨认的细节,由于总倍数太小,挤在一起难以分辨。 $ehg@WK}.
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(2)分辨率:显微镜的分辨力决定于物镜数值孔径,孔径愈大,分辨率愈高。数值孔径与物镜倍数有关,请看下列数字: @PcCiGZ
物镜倍数 4× 10× 20× 40× 100× Qp!Y.YnPd_
数值孔径 0.1 0.25 0.40 0.65 1.25 Xi~9&ed#$i
上列数字表明,随着放大倍数的加大,数值孔径相应提高,分辨力随之增大,欲提高对物象细节的分辨能力和清晰度,必须使用高数值孔径的物镜。例如,拍摄染色体减数分裂前期Ⅰ的几个影象,非用高分辨率的油镜不可,摄影目镜应视物象的大小和视野宽度,选用低倍的目镜为宜。在这里要考虑物镜的数值孔径,不是总放大率,单纯考虑放大倍数,不顾及分辨率,就会出现摄影质量相差悬殊的结果。例如,用100/1.25物镜与4×目镜组合,总放大倍数为400倍,分辨距离为0.27微米;使用40/0.65的物镜与10×目镜组合,总放大倍数也是400倍,分辨距离下降到0.5微米。尽管总放大倍数相同,物象微细结构的分辨力几乎相差一倍。 ~/`X*n&
(3)焦点深度和视野宽度:焦点深度是指物象的某一点被准焦时,其清晰部分的上下距离(厚度)。焦深大,清晰的深度大,焦深小,清晰的深度小。染色体数目较多的植物,例如八倍体小黑麦2n=56,制片时难以把所有染色体平展一薄层,56条染色体纵横交错,散在不同的水平层次上。因此,若缺少足够的焦点深度,难把众多的染色体清晰地反映在同一张底片上。焦点深度与物镜的数值孔径和总放大倍数成反比。数值孔径小,放大倍数低的物镜和目镜,焦深长,只有选用数值孔径小和放大倍数低的物镜和目镜,加长焦点深度,才能把处于不同水平层次的染色体,清晰地摄入同一张底片内。 {:Vf0Mhb
视野宽度与显微镜的总放大率成反比,使用高倍物镜和目镜,视野缩小,难在同一视野内容纳一个细胞的全部染色体。改用低倍的物镜或目镜,降低总放大率,放大视野,以至能包括一个细胞的所有染色体止。 Z|`fHO3j
综上所述,物镜数值孔径大,分辨率高,物象清晰,焦点深度和视野宽度降低,选用物镜和目镜主要着眼于提高物体影象的分辨率和清晰度,即选高数值孔径的平象复消色差中、高倍油浸物镜,兼顾焦点深度和视野宽度,并选用相宜的低倍摄影目镜或平象目镜。焦深和视野不足时,适当调换物镜,降低数值孔径或放大倍数。 M<