流式细胞仪(思路较完整版)

已经公开的项目就干脆完成掉....补充一些PPT里没有的东西

本来打算贴在PPT后面更,发现有下载的后面的跟贴根本和没法一样

,干脆另起一贴. 原贴内除PPT外跟贴项目内容删除...

只管工程项目本身的大体,不在意具体结构的细化,所以不会是最完美的结果.

更新较慢,
临时填加,内容难免前后有个别信息重复,

niejl@jinlioptics.com
杭州瑾丽光电

niejl

2016-09-29 10:45

首先来看细胞本身。。。
[attachment=72717]（转自百度图片）
我们需要检测一些指标，以便半定量化或定量化地在一定程度上区分细胞类别，区分细胞是否癌变等。
以平行激光照射，细胞性状一定，细胞质折射率一定的情况下，其透射散射角就是基本固定的，而散射多少能量完全取决于细胞大小。
由于细胞壁和内核各种物质与周围体液，细胞质折射率不同，平行入射光会被个别位置全发射，在90度方向可以测到部分这种全反射光，当多次测量各种位置的细胞时，可视作均匀放射，可以半定量化地比较出一些细胞核内细微物质的区别。
细胞是否癌变，或细胞之间存在一些区别时，可以选择对特定物质标记的荧光剂，通过激发观测其是否被标定，浓度等等来判断是否有这种特定物质，含量多少来区分细胞之间的区别。。

niejl

2016-09-29 10:47

然后是测量细胞特征的基本原理
[attachment=72718]
结构包括2大块：
1.细胞的导流聚焦模块（细胞可在较细的位于透明稳定的石英材料中央的通道流动，可以通过水动力或声波聚焦技术使细胞排成一列并且保持在轴中央顺序前进）
2.激发及采集模块:
激发光源在垂直方向照射导流腔内顺序通过的细胞，当细胞通过时，光束通过细胞时产生了前向角散射B和侧向角散射A。如果细胞被荧光标记物标记，同时产生向4PI空间放射的荧光。

前向角散射散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。（此段转自百度百科）

细胞被荧光标记物标记后可被某固定波长光源激发产生特定波长荧光，这些荧光的强弱代表细胞膜表面抗原的强度，细胞内或核内物质的浓度。

niejl

2016-09-29 10:48

为达到准确测量的目的，需要了解测量过程的环境，影响因素及可使用材料的情况：
1.可能被用于标记的荧光，光谱都较宽没有锐线，准确可知，可校验。无需分辨率很高的分析装置。
[attachment=72719]
2.细胞存在自发荧光。
3.荧光强度与激发光强度相关。
4.由于荧光代表核内物质浓度，而细胞内物质位置不固定，所以其空间放射是不均匀的，又由于细胞质与体液虽有折射率差但不会很大，所以虽不均匀不会有过大的突变和大的量差异，这个只能通过实验获得数据。
5.荧光本身很微弱。
6.由于聚焦技术，细胞在导流腔内一定是延中心轴附近排列移动的，但测量时细胞在Z轴的位置是不固定的。
[attachment=72720]
7.测量细胞大小认为是大多数的<100um。

niejl	2016-09-29 11:00
1-7的条件未必完善 4e/cqN6 并且1-7条件内的个别内容虽然明确,但部分准确特性应该通过实验获得.. cQ,9Rnfl, 这里为纯粹思路只根据逻辑关系推测...

cyan	2016-09-29 13:58
很有意思的题目，我也来抛个小砖头 Fd}<Uote3 [attachment=72729]

niejl

2016-09-29 17:08

cyan:很有意思的题目，我也来抛个小砖头[表情] [表情] [表情] 9ec0^T
[图片] (2016-09-29 13:58) \N4d_fPj

集中在中间那条线的时候小细胞不大会受影响的
大细胞在100或者100UM以上方形腔肯定会有干扰
所以那导流腔真的该是直径200um或者300um的柱形才合适...不然不只荧光影响,散射更受影响啊...
不过猜测实际恐怕也和当初提的方形腔要求不同, 不然水动力聚焦效果就大打折扣了....

measure123	2016-09-30 05:06
内孔常用200*200um，方形的，一般叫流动室，Gem或Jap的质量较好

niejl	2016-09-30 08:59
measure123:内孔常用200*200um，方形的，一般叫流动室，Gem或Jap的质量较好 (2016-09-30 05:06) @X3 gBGY) N[#iT&@T}/ 方形是受加工工艺所限么还是?

石火光电	2016-10-15 10:47
高手在公司 sM#!Xl;

niejl

2016-11-21 08:23

工作太忙,不知道更得了更不了了....
上面的所有东西形成三个可能性约束:
1.光谱测试分辨率不需要很高,而是需要准确地判定染料的非窄带光谱及其强度...
2.全测试区域确实为200X200UM,可重点测试区域是200X100或200X150UM.
3.测量灵敏度要高,但高到什么程度是未知的,需要实验测试...
[attachment=73988]
这些都是图片里提到的,而且按照图片的推理,貌似一切都是可以成功的....但这个只是为了一个题目而已,实际这个项目按这么做早就挂了...

niejl

2016-11-21 08:43

由上面的3个条件之前的因素不只这里提到的这些
需要追加:
7.Z轴位置不只不固定,被采集过程还有可能是一半在区域内一半在区域外的
8.被照明目标存在侧向散射,而其侧向散射是可能影响相临细胞的
9.其实细胞的发光不是4PI空间的均匀分布.

他们确实会得到原来的3个技术要点但却有所不同
1.分辨率一致;
2.区域是否200UM,首先要根据荧光显微镜观察: A运动细胞统计间距,B运行速度,C排列方向(重点是同细胞每次开启关闭流动之后排列方式变化)
区域内无差别采集一致
3.效率及灵敏度不是可用,是必须可用灵敏度的至少2倍以上(前提是假设细胞统计最小中心距>2倍细胞大小,如果2的显微镜观测并非如此,灵敏倍率还要变化)..(原因是为了采集到准确数据,每个细胞等效时间需要拍照2次,从而去除非全细胞的失误数据)
而3的方式不是绝对的,还有一种采集方式是累积暴光最后分析,这种需要的灵敏度偏低,可以多次叠加暴光收集统计数据...
当然无论采用哪种,样品阶段都要以兼容为目的,连拍单细胞采集和累积暴光都可以做测试才行(已有机器抄袭例外,这里只讨论没有人做过此产品的情况下该如何进行)

niejl

2016-11-21 09:02

这些要点得到的和PPT实际也不同:
要点共同用得到的是:

1.可采用狭缝光谱仪及非运动细胞配合测试灵敏度,如果暴光速度很快,样品可以使用现有光谱仪
如果暴光速度过慢,要依据此次暴光得到的数据重新设计光谱仪

2.激发光要非常均匀,可以高频地开关,照明区域受限在采集区域内不止要集中大部分能量,而且边界要尽力截止防止区域外细胞被激发的影响(虽然荧光不会立刻消失,起码要防止来方向细胞的因素,因为这个有不确定性,去方向细胞的荧光干扰可以记录软件大概率排除)

3.激发光区域和采集区域的原则是,1/2细胞统计间距平均值或均方根的整数倍,根据灵敏度测试及使用要求确定整数的上下限.

4.区域内任何空间点的激发采集都要是一致的,或根据要求差异不大于?%\

5.目标采集角度根据两个条件确定,A是灵敏度,B是观测细胞方向,这个比较复杂如果观测多细胞方向全部随机那么B忽略, 如果观测多细胞方向全部相似B忽略, 如果观测多细胞方向较为一致但每次关闭开启后由于聚焦条件变化多次开关整体不同就要测试荧光发光角度(接下来的讨论假设这种低概率情况不存在,假设显微镜观察到的所有细胞都是随即方向的)
这条按照细胞方向随机以灵敏度判定采集角度, 并假设已采购光谱仪测试灵敏度完成得到结论全30度水中张角的采集加上重新设计的光谱仪能达到之上2倍可用灵敏度.

niejl	2016-11-21 09:03
继续干活,过段时间再更吧..............

measure123	2016-11-30 16:57
感觉用荧光显微镜来测难度有点欠准确，遇到的干扰光会较多。流式细胞仪，光学是核心检测子系统，但与你配合的液路和硬件同样非常关键。光学系统做的再好，如果相关子系统扯后腿，最后的效果会比你预想的差得多。

xull127

2016-12-01 09:25

measure123:感觉用荧光显微镜来测难度有点欠准确，遇到的干扰光会较多。流式细胞仪，光学是核心检测子系统，但与你配合的液路和硬件同样非常关键。光学系统做的再好，如果相关子系统扯后腿，最后的效果会比你预想的差得多。 (2016-11-30 16:57) SqA+u/"j2

没错，这应该只是一种概率统计后的半定量方法，不是完美方法。看将来进步会不会有更优方法了。

wmh1985	2017-09-19 11:21
谢谢楼主！不知道，您对于前向散射角，有没有研究！

wmh1985	2018-08-29 09:49
散射通道和荧光通道收集信号的透镜，与石英池之后的透镜，放大倍数多少会比较适合了？还是说只要在检测器光敏区范围内均可？

daniellsun	2022-11-15 16:11
感谢分享

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