| moonljy |
2005-11-03 14:04 |
医用显微镜应用的若干光学技术
医用显微镜是对微小物体，如人体组织、细胞、血球以及细菌、病毒等进行观测和分析的光学仪器。一个生物体放大1000倍后，就可以进行组织（组织学）和细胞（细胞学）以及病理（病理学）的诊断和研究。 & /FwV'
标准的光学显微镜通常由目镜和物镜两个部分组成光学系统，主要是凹凸透镜的组合使用。物体经目镜和物镜二次放大，所以显微镜的放大率是目镜和物镜放大率的乘积。同时，通过光路计算可得出，显微镜的镜筒愈长，目镜与物镜的焦距愈短，放大率就愈大。 Bzt`9lg
显微镜的另一个重要特性是分辨能力，分辨率是由物镜的数值孔径（NA）决定的，NA一般为0.65，最大为1.5~1.6。数值孔径越大，分辨能力就越高。 :A iu!}\
但是，显微镜能够获得的最高放大倍数是受到可见光的波长限制的。因为可见光的波长范围是从400到700 nm（0.4~0.7 μm），所以能够分辨的最小物体约为1 μm直径。由于大多数细胞的直径是5~50 μm，因此，光学显微镜是适合于分辨大于亚细胞的所有物体。并且，通过光学技术的组合运用，光学显微镜的最高分辨率可以提高到0.2 μm左右。一般地说，提高物镜的分辨率有两种方法：一种是把物镜浸在油或水里，来增加其数值孔径，另一种是利用波长短的光，如紫外线，可把分辨率提高一倍。 Q31c@t
在光学显微镜的光学操作中，使用三个基本原理：反射、折射和衍射。 l#.,wOO {
1. 相衬显微镜技术——因为大多数细胞对于所有波长的可见光是透明的（除了血红细胞以外），所以薄的组织切片在显微镜下是看不到什么的。为了分辨不同的细胞，通常需要用强烈吸收某些波长可见光的化学品（如染料）把它们染色，不同的化学品用于染不同的细胞成分，从而得以帮助辨认细胞的结构。但是，染色的程序相当繁杂，并且有时会伤害有机体的生命力。 |Cq J2
有一种光学技术是利用细胞不同部分的不同折射率。因为光在细胞的不同部分以不同的速度传播，所以光波的相位关系在经过样品时就会改变，相衬显微镜就利用了这个折射现象使细胞结构得以见到而不用染色。这类显微镜主要是在直射光的会聚点处增加一块透明的平行平面板，来增加板像的衬度，以便分辨。实用上是采取方形、十字形、环形的相板，而环形相板用得最多。它是在平行平面板上镀覆一层或多层氧化镁或冰晶石（氟化铝和氟化钠）薄膜制成。 zm"g,\.d
所谓相衬是通过平行平面板的结构，使穿过组织的光束与导向某一光学上一致区域的参考光束接合在一起，这个组合光束相互干涉，从而在相消干涉的地方产生黑暗区域，而在相长干涉的地方产生明亮区域。这与水面上一个油点所看到的彩色圆环是一样的基本原理。 tX}S[jdq
2.荧光显微镜技术——荧光显微镜是一种对于能发出荧光的物质或经荧光色素染色后能发出荧光的物质进行观察的显微镜。荧光显微镜的光源是紫外光或蓝紫单色光。组织样品是用染料染色的，这种染料被紫外线辐照激发时会发出荧光，然后通过适当的滤光片，就能观察到几乎所有的有机分子。 ,]qX_`qF
某些荧光染料对鉴别细胞的类型是有用的，例如，有一类叫做嗜酸性细胞的白血细胞，就是因为它接受一种曙红的荧光染料，而被观察到。有时候，用于荧光显微镜的细胞染色可以在活体内完成。例如，当一个病人被给予四环素后，它的一部分就混合到新生长的骨中，在新的骨生长部位采取样品，把它放入荧光显微镜时，就会发出黄色或橙色的荧光。 VjM uU"++@
荧光显微镜使用的紫外光源是水银弧光灯，位于显微镜附属的屏蔽盒中，紫外光顺着观察者的视线直接落在经过染色处理的样品上，从而激发出荧光，突出组织或细胞的结构或异常的特性，看到在一般照明下看不到的图像。 L4Y3\4xXO
3.消除色差的透镜技术——在可见光谱中，红光有最长的波长，并且与可见光谱另一端的紫光相比，不太容易散射。显微镜的光源发射具有在红与紫之间所有波长（即所有颜色）的连续光谱，每个波长都会以不同程度的折射和反射，并到达稍微不同的焦点上。这个现象叫做色差，在高倍放大时非常明显。 ;CBdp- BUj
图像经历色差后，具有难以确定的边界。发生颜色或亮度变化的任何边界，会被由光束沿边缘衍射而引起的红和蓝线所突出。对此问题有两个解决办法。 #v wXx r
用于制造显微镜所用透镜的光学玻璃是不可能完全一致的，而且透镜的涂复也有不同的变化。因此，第一个解决办法是采用复消色差的透镜，复消色差透镜有一层涂覆，以消除由于衍射而引起的波阵面的分离，从而不会显现出像彩虹那样的边缘，但费用较大。第二个校正色差的方法是使用校正透镜。即，如果弯曲的透镜前面在光束中引起失真，那么一个相反的弯曲透镜就能够部分地恢复光束。光学显微镜的最简单的透镜由安装在镜筒中的单玻璃片组成，以方便操作。而大多数透镜由多个玻璃片组成，安排在镜筒中，以在提供组合放大的同时校正色彩。这与焦点到样品的距离无关。 ^ w1R"qE"m
4.低能X线技术——有时候在显微镜中使用X线技术是有利的，这种用于显微镜检查的低能X线技术，叫做组织射线照相术。X线集束穿过与细粒胶片紧密接触的组织样品，而合成的X线影像则在传统的显微镜下考察。因为低能X线可被重分子（如钙之类）强烈吸收，所以组织射线照相术常常用于研究已切成薄片（~ 0.1 mm）的骨样品。 Bz~h-
5.蓝色玻璃滤片技术——在显微镜光源和样品之间的某些点上，可设计彩色滤片以校正由光源发射的色谱。因为所有的灯不可能是完全一致的，按照维恩位移律，由热物体发射的光谱是直接与物体的温度有关的，相对地冷的物体，像电炉加热元件，在约1700K时发出暗红光；而热的物体，像钨灯丝在3000K时发出几乎是白色的紫光，而直接对它看是难受的。 [ i#Gqx>'w
当物体的温度增加时，最大的波长（即红色）向光谱的紫色端转移，导致“较白”的光。在较低的温度时，灯丝可以发射某些蓝色和紫色的波长。然而，此光谱仍然含有足够的“温暖”颜色，以给出图像的一个红色或橙色的色调。蓝色滤片就可以阻挡更长的“温暖”颜色，足够来产生在所有强度水平上的“白”光，以便清晰地观察组织样品。 YcZ4y@6"
6.提高放大倍率的波长选择技术——在光学显微镜上，2000倍的放大率，一般地被认为是对于具有标准光学零件的传统光学显微镜的放大率的绝对限度。大多数具有油透镜的光学显微镜停留在1600倍上，就是在这一点，或者衍射变成过分地难以聚焦一个图象，或者使用可见光来看则结构太小。为了能够观察，在检视下的样品特征必须大于所使用的光的波长。例如，如果考虑一个550纳米（绿光）的中等波长，那么容易观察到具有75000纳米（或75微米）的血红细胞。最小的细菌在500纳米时显现为模糊的阴影，而较大的样品在10000纳米则可清晰地分辨。在50纳米大小的病毒是难以探测的，光线环绕在病毒周围，因为光的波长太大而被微粒吸收。这与无线电波不能被电话杆阻挡但可被建筑物阻挡的道理是一样的。但是，视频图像的计算机处理能够展示人们在正常情况下不能看到的美妙事物。 M oHvXp;X
7.暗场与偏振光技术——在白光下，物镜最多能分辨0.2 μm，若照明光束不直接射入物镜，则视场呈黑暗状态，通过目镜就可以观察到0.1μm甚至更小的超显微粒子（如某些病毒）。这类暗场显微镜一般采用侧向照明或落射光侧向照明。 | :[vpJFK
偏光显微镜主要是增加了两个偏光镜，利用光的偏振特性对具有双折射性的物质进行精细结构的观察，如齿、骨、头发、指甲、卵巢、活细胞的结晶内含物、神经纤维、肌肉等。又因在旋光性方面，正常细胞对偏振光左旋，而肿瘤细胞对偏振光右旋，所以还可进行癌症的鉴别。
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