| starshine |
2008-03-04 10:18 |
第一节 金相显微镜 o Rfb4+H&
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前面讲述了显微镜的光学原理以及附件，下面将分类介绍一下各类研究用镜检术。在材料研究领域，反射式明场显微镜得到广泛应用，在此基础上各种特殊的镜检方法也得到应用，如暗场，偏光，相衬，干涉，荧光，这些镜检方法在高档显微镜上均能同时实现。 VPN
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一． 明视野观察（Bright field） Za.}bR6 ?Y
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明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切 片，所有显微镜均能完成此功能。在此不再赘述。 {uDW< u_!
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二． 暗视野观察（Dark field） X[z;P!U
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暗视野实际是暗场照明。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则 呈现明亮的像。暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现像，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反 射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其 斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射的光形成明亮图像。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达0.02— 0.004mm。 =^"Sx? ?V
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三．相衬镜检法（Phase contrast） v gW(l2,@
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在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。 y"?`MzcJ0
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相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现像，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜。 hV3]1E21"
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1. 相衬镜检法在装置上与明场不同，有一些特殊要求： (lsG4&\0F
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( 1 )． 环状光阑（Ring slit）： 装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。 hB?#b`i ^
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( 2 )． 相板（Phase plate）： 装在物镜的后焦平面处，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面；另一是通过衍射光的部分，叫“补偿面”。有相板的物镜称“相衬物镜”，外壳上常有“Ph”字样。 >^8O :.
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2. 相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法，想要得到好的观察效果，显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面。 R ENCk (
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( 1 )． 光源要强，全部开启孔径光阑； g}9 ,U&$]y
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( 2 )． 使用滤色片，使光波近于单色； `(W"wC
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四．微分干涉相衬镜检术（Differential interference contrast DIC） G > ~/
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微分干涉相衬镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图像呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。 m?-)SA
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1． 原理 EXdX%T\
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微分干涉相衬镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现像，使图像呈现出立体的三维感觉。 jLFaf# G]
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2． 微分干涉相衬镜检术所需的特殊部件： >A )Sl'
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（1） 起偏镜 Y]
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（2） 检偏镜 ]W3u ~T*
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（3） 渥拉斯顿棱镜2 块 /G5KNSi
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3． 微分干涉镜检时的注意事项 FC 8<D
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（1）因微分干涉相衬灵敏度高，制片表面不能有污物和灰尘。 4n#u?)
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（2）具有双折射性的物质，不能达到微分干涉相衬镜检的效果。 l(Y32]Z
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（3）倒置显微镜应用微分干涉相衬时，不能用塑料培养皿。 ]xf89[ ;0
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五 . 荧光镜检术 <mX5VGY9^
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荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。荧光镜检术广泛应用于生物，医学等领域。 5ncW
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1．荧光镜检术一般分为透射和落射式两种类型。 %g*nd#wG
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（1）透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸物镜下较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不适用于非透明的被检物体。 $%U}k=-
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（2）落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。 3SM'vV0 [
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2．荧光镜检术的注意事项 D ~inR3(}
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（1） 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现像，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。 ^uX"04>;
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（2）作油镜观察时，应用“无荧光油”。 A@M2 (?w4
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（3）荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。 H#F"n"~$
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（4）电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。 *7*_QW%?A
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目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜，如基因原位杂交（FISH）等等。 tL&_@PD)3
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第二节 偏光显微镜（Polarizing microscope ） < S_0=U
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一．偏光显微镜的特点 4 Zjd g`
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偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨清楚，当然这些物质也可用染色发来进行观察，但有些则不 可能，而必须利用偏光显微镜。偏光显微镜的特点，就是将普通光改变为偏光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双 折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物学和植物学也有应用。 y 2k's
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二．偏光显微镜的基本原理 SdufI_'B
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偏光显微镜的原理比较复杂，在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件（a）起偏镜 （b）检偏镜 （c）专用无应力物镜 （d）旋转载物台。 &WCVdZK:
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三． 偏光镜检术的方式 Yy!G?>hC
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（一） 正相镜检（Orthscope）：又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（Bertrand Lens）,同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。 "%
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（二） 锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。 h1)+QLI
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四． 偏光显微镜在装置上的要求 r& RJ'z
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（一） 光源：最好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现像因波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。 *~`oA~-Q
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（二） 目镜：要带有十字线的目镜。 fk#Ggp<
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（三） 聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。 ( ^=kV?<
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（四） 伯特兰透镜：这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。 T~>&m~} +
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五． 偏光镜检术的要求 NFU=PS$
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（一） 载物台的中心与光轴同轴。 wMH13i3
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（二） 起偏镜和检偏镜应处于正交位置。 3,+Us B%
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（三） 制片不宜过薄。 4 [0.M
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第三节 体视显微镜（Stereo microscope） +w?1<Z
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体视显微镜又称“实体显微镜”或“解剖镜”，是一种具有正像立体感地目视仪器，被广泛地应用于生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。它具有如下地特点： 5OFb9YX
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1． 双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角——体视角（一般为12度---15度），因此成像具有三维立体感； .|ZnU]~T
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2． 像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故； KrECAc
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3． 虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长 l ce~6}
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4． 焦深大，便于观察被检物体的全层。 Bsz;GnD|r
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5． 视场直径大。
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